Le microscope optique et les colorations

Le microscope optique est l'outil que tu croiseras dans presque tous les laboratoires, du lycée de Ouagadougou au laboratoire d'analyses de Montréal. Tu vas d'abord comprendre comment il agrandit une image, pourquoi il ne peut pas tout montrer, et comment préparer ce que tu poses sous l'objectif. Tu vas surtout apprendre à choisir une coloration en fonction de ta question. C'est une compétence qu'on néglige souvent : on colore par habitude, alors qu'un colorant mal choisi peut cacher justement ce qu'on voulait voir.

Le principe est simple. Une lampe envoie de la lumière à travers un échantillon assez mince pour la laisser passer. Une première lentille, l'objectif, forme une image agrandie. Une seconde, l'oculaire, celle où tu poses l'œil, agrandit encore cette image. Pour connaître le grossissement total, tu multiplies les deux valeurs gravées sur les lentilles. Avec un oculaire marqué dix et un objectif marqué quarante, tu observes à quatre cents fois. Note toujours ce grossissement à côté de ton dessin ou de ta photo : sans lui, personne ne peut retrouver la taille réelle de ce que tu as vu.

Regarde de loin, la nuit, un taxi-brousse qui arrive : ses deux phares se confondent d'abord en une seule lumière, puis se séparent quand il approche. Le pouvoir de résolution, c'est cela : la plus petite distance à laquelle deux points restent distincts. Pour un microscope optique, cette limite est d'environ deux cents nanomètres, soit 0,2 micromètre, et aucune lentille ne la franchit, car elle tient à la longueur d'onde de la lumière visible. Agrandir davantage l'image ne fait qu'agrandir le flou. Le plus fort grossissement utile s'obtient avec l'objectif × 100, dont la lentille trempe dans une goutte d'huile : avec l'oculaire × 10, tu observes à mille fois. Une bactérie apparaît alors comme un petit bâtonnet ou une petite sphère, mais ses ribosomes resteront toujours invisibles avec cet instrument.

Avant de préparer quoi que ce soit, demande-toi si tu as besoin que la cellule reste en vie. Si oui, dépose ton échantillon dans une goutte d'eau et pose la lamelle de biais, pour chasser les bulles. Tu verras une paramécie nager ou le cytoplasme tourner dans une feuille d'élodée. Le prix à payer : sous la lampe, la goutte sèche en quelques minutes, et rien n'est coloré. Si tu cherches plutôt la forme ou un colorant, étale une fine couche sur la lame, laisse sécher, puis fixe-la, soit par une chaleur douce, soit avec quelques gouttes d'alcool loin de toute flamme. Les cellules meurent, mais elles restent collées et gardent leur forme pendant les rinçages. Pour un tissu épais, comme une racine ou un morceau de foie, il faut une coupe très fine, sinon la lumière ne passe pas.

Sans colorant, une cellule ressemble à une bulle de verre posée sur la lame : on devine ses bords, presque rien de son intérieur. Le bleu de méthylène se fixe sur les acides nucléiques et marque fortement les noyaux : frotte doucement l'intérieur de ta joue avec un cure-dent neuf, étale sur une lame, ajoute une goutte de bleu, et les noyaux apparaissent. L'eau iodée, qu'on appelle aussi lugol, colore l'amidon en bleu-noir : essaie sur une fine râpure de pomme de terre ou de manioc. Le rouge neutre, lui, s'accumule dans les vacuoles de cellules encore vivantes. Un colorant n'est jamais sans effet : une paramécie plongée dans l'eau iodée cesse vite de nager. Avec la levure, on en fait même un test : dans du bleu de méthylène dilué, les cellules vivantes décolorent le bleu et restent claires, les cellules mortes deviennent bleues.

En 1884, le médecin danois Hans Christian Gram met au point une méthode qui partage les bactéries en deux camps. Tout se joue à un moment précis : le rinçage à l'alcool. Avant lui, toutes les bactéries ont été teintées par le violet de gentiane, et le lugol a formé avec ce colorant de gros complexes. Une paroi épaisse de peptidoglycane, resserrée par l'alcool, retient ces complexes : la bactérie reste violette, on la dit Gram positif. Une paroi mince, doublée d'une membrane externe que l'alcool dissout, les laisse s'échapper : la bactérie redevient incolore, puis prend le rose de la safranine ajoutée à la fin. On la dit Gram négatif. Ce tri oriente le travail d'un laboratoire, mais il ne donne jamais à lui seul le nom exact d'une bactérie.

Avant d'ouvrir un flacon, écris en une ligne ce que tu veux voir : c'est cette ligne qui décide de la préparation. Tu veux voir des cils battre ou une amibe avancer ? Observe vivant, sans colorant, en baissant un peu la lumière pour gagner du contraste. Tu veux compter des noyaux ? Bleu de méthylène sur un frottis. Tu veux savoir si une graine ou un tubercule stocke de l'amidon ? Eau iodée. Tu veux savoir si les bactéries d'un yaourt sont des bâtonnets ou des sphères, et à quel groupe elles appartiennent ? Frottis, Gram, puis objectif à immersion. Une ligne écrite à l'avance t'évite trois lames ratées.

Voici l'essentiel. Le grossissement total s'obtient en multipliant l'objectif par l'oculaire. La résolution du microscope optique s'arrête vers 0,2 micromètre : au-delà, grossir ne sert à rien. On observe vivant pour voir un mouvement, on fixe pour colorer et garder la forme. Et chaque colorant répond à une question : bleu de méthylène pour les noyaux, eau iodée pour l'amidon, Gram pour trier les bactéries. Dans la prochaine leçon, tu passes au microscope électronique, qui voit beaucoup plus fin, et tu apprends à lire ses images comme une carte.